Vinhthinh Biostadt JSC

Một dịch bệnh mới trên tôm nuôi được phát hiện gần đây có tên là “Hội chứng tôm chết sớm” (Early Mortality Syndrome - EMS) hay “Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính” (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND) lần đầu tiên được báo cáo trên tôm nuôi tại Trung Quốc vào năm 2009 và sau đó ở các nước khác như Việt Nam (2010), Thái Lan (2011), Malaysia (2011) và Mêhicô (2013). 

Dịch bệnh EMS/AHPND thường ảnh hưởng đến tôm nuôi sau khi thả giống khoảng 20-30 ngày và có thể gây chết đến 100%. Liên Minh Nuôi trồng Thủy sản Toàn cầu đã ước tính thiệt hại do dịch bệnh này gây ra cho ngành công nghiệp nuôi tôm khoảng 1 tỷ USD. Bài viết này cung cấp một số thông tin nghiên cứu mới nhất về tác nhân gây bệnh, phương pháp chuẩn đoán bệnh và biện pháp phòng tránh bệnh EMS/AHPND trên tôm. 

1. Tác nhân gây bệnh EMS/AHPND là gì? 

- Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus: Năm 2013, Phòng nghiên cứu Bệnh học Thuỷ sản, Trường Đại học Arizona (Phòng nghiên cứu bệnh thủy sản của GS. Donald Lightner - UAZ-AP) nghiên cứu và chỉ rõ nguyên nhân gây bệnh được cho là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus – một loài vi khuẩn rất phổ biến trong môi trường nước. Tuy nhiên, chúng ta vẫn chưa biết được rõ ràng là có phải chỉ do một chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus gây nên EMS/AHPND hay do nhiều chủng vi khuẩn gây nên. Những nghi ngờ này đã được chứng minh khi liên tục có những công bố khoa học mới trong thời gian gần đây cho thấy một số chủng vi khuẩn khác thuộc nhóm Vibrio cũng gây nên bệnh EMS/AHPND.

- Vi khuẩn Vibrio harveyi ATCC BAA-1116: Tháng 9/2015, một nghiên cứu được công bố cho thấy chủng vi khuẩn Vibrio harveyi mới gây bệnh EMS/AHPND trên tôm nuôi tại Việt Nam.

Phân tích trình tự gen của vi khuẩn này cho thấy nó có họ hàng gần nhất với chủng vi khuẩn Vibrio harveyi ATCC BAA-1116. Một tìm kiếm tương đồng (homology search) bằng cách sử dụng các gen dự đoán (predicted genes) cũng cho thấy có sự tương đồng cao với các gen của vi khuẩn V. harveyi và Vibrio campbellii hơn là so với vi khuẩn V. parahaemolyticus.

Kết quả nghiên cứu cho thấy trình tự gen của loài vi khuẩn Vibrio gây bệnh AHPND trên tôm không phải là vi khuẩn V. parahaemolyticus như đã công bố trước đây. Chủng vi khuẩn này cũng tồn tại các gen độc tố và có trình tự giống với plasmid đã biết. Dòng vi khuẩn này có trình tự gen giống với V. harveyi, có nghĩa là các gen độc tố có thể được truyền từ loài vi khuẩn Vibrio này sang loài vi khuẩn Vibrio khác. 

- Một chủng vi khuẩn khác thuộc Vibrio harveyi: Tháng 2/2016, theo báo cáo của tổ chức Thú ý Thế giới OIE (the World Organization for Animal Health), một dịch bệnh mới đang bùng phát trên tôm sú nuôi tại bang Queensland, Úc. Tỷ lệ chết trên tôm sú nuôi xuất hiện trên diện rộng tại nhiều trang trại nuôi tôm ở khu vực này. Theo đó, dịch bệnh này xuất hiện trên tôm nuôi từ 35-95 ngày sau khi thả giống. Tỷ lệ chết dồn tích có thể lên đến 90%. Những con tôm chết có dấu hiệu tổn thương hệ thống gan tụy.

Các phân tích mô bệnh học trên tôm bệnh phù hợp với các dấu hiệu của bệnh hoại tử gan tụy cấp tính AHPND đã được báo cáo trước đó. Tuy nhiên, bệnh này không thỏa mãn với các định nghĩa về bệnh AHPND trên tôm được cung cấp bởi OIE.

Hiện tại, các thông tin chuẩn đoán bệnh này được mô tả dưới đây:

+ Một chủng vi khuẩn khác thuộc loài Vibrio harveyi được phân lập trên tôm nhiễm bệnh. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus - tác nhân gây bệnh EMS/AHPND không có liên quan đến bệnh mới xuất hiện này.

+ Xét nghiệm PCR với các cặp mồi AP3 và AP4 cho thấy vi khuẩn phân lập được từ tôm nhiễm bệnh cho kết quả dương tính với các gen gây độc PirA và PirB. PCR với hai cặp mồi AP1 và AP2 cho kết quả âm tính, cho thấy không có sự hiện diện của plasmid pVA1 liên quan đến bệnh EMS/AHPND (hai cặp mồi AP1 và AP2 cho kết quả dương tính với bệnh EMS/AHPND trên tôm nuôi tại khu vực Châu Á).

+ Kết quả giải trình tự sơ bộ bộ gen của loài vi khuẩn này cho thấy có sự hiện diện của hai gen độc tố PirA và PirB.  

+ Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm đang được tiếp tục triển khai để hoàn thành việc giải trình tự toàn bộ bộ gen, phân lập và định danh vi khuẩn này. Các phân tích sinh học đang được tiến hành để xem xét khả năng gây bệnh của chủng vi khuẩn mới này. Một cuộc khảo sát trên toàn quốc sẽ được tiến hành để xác định sự phân bố của bệnh.

+ Nguồn gốc của sự bùng phát dịch bệnh: Chưa xác định được

+ Phòng bệnh/kiểm soát bệnh: Khử trùng, kiểm dịch, giám sát sự bùng phát của dịch bệnh 

2. Phương pháp PCR mới phát hiện bệnh EMS/AHPND trên tôm có độ nhạy gấp 100 lần so với phương pháp cũ

Một nhóm các nhà nghiên cứu ở Thái Lan và Đài Loan, đứng đầu là Giáo sư T.W. Flegel và C.F. Lo đã phát triển phương pháp PCR để phát hiện vi khuẩn gây bệnh gan tụy cấp EMS/AHPND trên tôm. Tháng 12/2013, nhóm nghiên cứu này đã công bố thông tin chi tiết phương pháp PCR bao gồm trình tự mồi (primers) và cả quy trình cho việc phát hiện mầm bệnh bằng kỹ thuật PCR. Đây là thông tin đầu tiên về phương pháp phát hiện vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND trên tôm bằng kỹ thuật PCR. 

Tháng 6/2014, nhóm nghiên cứu của Giáo sư Tim Flegel đã công bố một phương pháp PCR mới và cải tiến có thể phát hiện chính xác 100% mẫu tôm nhiễm EMS/AHPND. Phương pháp này dựa trên cặp mồi AP3 nên thường được gọi tắt là “AP3”. Giáo sư Tim Flegel cho biết: “Đây là thông tin chi tiết về một phương pháp PCR mới, hoàn toàn miễn phí để phát hiện chính xác 100% vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND. Quy trình PCR này đã được cải tiến so với quy trình PCR chúng tôi phát hành miễn phí vào tháng 12 năm 2013. Quy trình này đã được công bố ở Hội nghị về tôm tại Zhanjiang, Trung Quốc vào ngày 18/06/2014”. 

Mới đây, vào tháng 2/2015, nhóm nghiên cứu của Giáo sư Flegel tiếp tục công bố phương pháp nested PCR (PCR hai bước) cải tiến mới gọi là “AP4” có thể phát hiện vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND với độ nhạy cao gấp 100 lần so với phương pháp cải tiến (AP3) được công bố vào tháng 6/2014. Bởi vì độ nhạy cao của phương pháp mới này nên bước nuôi tăng sinh vi khuẩn trong phương pháp sử dụng cặp mồi AP3 là không cần thiết, nó giúp rút ngắn thời gian và đơn giản hơn trong quy trình thực hiện. Tuy nhiên, phương pháp này không hẳn là một sự thay thế cho phương pháp AP3 mà nó đơn giản chỉ là có thêm một sự chọn lựa cho người dùng khi cần một phương pháp phát hiện bệnh EMS/AHPND có độ nhạy cao hơn. 

Phương pháp AP4 đã được thử nghiệm với 104 mẫu vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND phân lập được. Kết quả thử nghiệm cho thấy kết quả giống 100% với phương pháp PCR AP3. Tuy nhiên, phương pháp này có thể phát hiện mẫu nhiễm EMS/AHPND thấp hơn 100 lần so với phương pháp AP3, tức là nó có độ nhạy cao gấp 100 lần so với phương pháp AP3.

Điều đặc biệt là phương pháp này được công bố rộng rải và miễn phí đến tất cả mọi người để có thể áp dụng trong việc chuẩn đoán, phát hiện vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND trên tôm.

Chi tiết quy trình PCR AP4 phát hiện EMS/AHPND 

- Ly trích DNA

DNA từ dạ dày, ruột hoặc mô gan tụy tôm, từ phân của tôm bố mẹ hay tôm post, hoặc từ tôm post (nguyên con) hoặc cua còng, giáp xác trong ao (vật lan truyền hoặc có thể mang mầm bệnh) hoặc bùn đáy ao,… Đối với mẫu vi khuẩn, có thể lấy trực tiếp khuẩn lạc để ly trích DNA. Hàm lượng DNA trong 25 µl phản ứng PCR khoảng 1 ng đối với DNA phân lập từ vi khuẩn hoặc khoảng 100 ng DNA phân lập từ mô tôm bệnh.    

- Thông tin về mồi cho phản ứng PCR (PCR primer)

Trình tự 2 cặp mồi cho phản ứng nested PCR. Sản phẩm khuếch đại ở bước 1 khoảng 1269 bp và 230 bp ở bước 2

- Thành phần và điều kiện phản ứng nested PCR 

+ Thành phần và điều kiện phản ứng PCR bước 1

+ Thành phần và điều kiện phản ứng PCR bước 2

- Điện di

Sản phẩm khuếch đại PCR được chạy điện di trên gel agarose 2% (2 g garose/100 ml dung dịch đệm), sau đó nhuộm bằng dung dịch ethidium bromide, đọc kết quả dưới đèn UV.

- Đọc kết quả

Mẫu dương tính với AHPND/EMS xuất hiện vạch có kích thước tương đương khoảng 1269 bp ở bước 1 và 230 bp ở bước 2, trong khi mẫu âm tính không có vạch nào xuất hiện trên gel sau khi điện di và soi dưới đèn UV. 

3. Phương pháp mới kiểm soát dịch bệnh EMS/AHPND trên tôm nuôi 

Tôi cho rằng giải pháp khử trùng đáy ao và nước ao nuôi tôm để diệt vi khuẩn gây nên EMS/AHPND sẽ góp phần vào việc lan truyền dịch bệnh này chứ không phải kiểm soát nó, và một giải pháp quản lý hệ vi sinh vật trong ao nuôi tôm mới là chìa khóa của vấn đề trong việc giảm thiểu những rủi ro của dịch bệnh EMS/AHPND. Thả giống tôm trong một môi trường đã được làm giàu bởi hệ vi sinh vật (ví dụ như môi trường nước xanh có nhiều vi tảo hay môi trường có nhiều vi sinh vật có lợi) nhằm hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật có hại thuộc nhóm Vibrio nhờ vào khả năng cạnh tranh tự nhiên của chúng với nhau trong môi trường, điều này có thể đảm bảo tốt nhất trong việc giảm thiểu những rủi ro do dịch bệnh EMS/AHPND. 

Một số loài phiêu sinh động vật thường xuất hiện trong môi trường ao nuôi

Việc sử dụng các hóa chất khử trùng để tiêu diệt các mầm bệnh tiềm năng trong ao trước khi thả giống sẽ làm xáo trộn hệ vi sinh vật trong ao nuôi và điều này sẽ gây hại nhiều hơn là có lợi. Việc gia tăng sự tích tụ các chất dinh dưỡng trong ao nuôi sau khi khử trùng kết hợp với hệ vi sinh vật nghèo nàn (do chúng bị tiêu diệt bởi hóa chất) sẽ làm giảm sự cạnh tranh đối với nhóm vi khuẩn có hại như Vibrio spp. Hoạt động diệt khuẩn trước khi thả giống tôm này vô tình tạo điều kiện thuận lợi cho nhóm vi khuẩn có hại phát triển dễ dàng trong ao nuôi và làm gia tăng khả năng bùng phát dịch bệnh EMS/AHPND trên tôm. Trong thực tế, chúng ta đã học được một bài học tương tự đối với nhóm vi khuẩn Vibriogây bệnh phát sáng vào những năm 1990. Bệnh này có nguyên nhân là do vi khuẩn Vibrio harveyi và các loài vi khuẩn khác có liên quan thuộc giống Vibrio. Bệnh phát sáng trên tôm thường xuất hiện khoảng 10-45 ngày sau khi thả giống. Sự bùng phát của dịch bệnh này có nguyên nhân là do sự gia tăng đáng kể của nhóm vi khuẩn Vibrio trong nước, do sự tích tụ dinh dưỡng trong ao tăng lên khi cho tôm ăn và không còn các vi sinh vật khác để cạnh tranh về môi trường sống hay dinh dưỡng với chúng.

Nước xanh (greenwater) với quần thể tảo chiếm ưu thế    

Trong những năm qua, các giải pháp kiểm soát dịch bệnh EMS/AHPND chủ yếu dựa trên các kinh nghiệm sản xuất thực tế, và đã được thảo luận ở nhiều các cuộc hội thảo, hội nghị chuyên ngành. Ví dụ như, người ta nhận thấy bệnh EMS/AHPND thường không xuất hiện ở những ao nuôi có nhiều động vật giáp xác chân chèo (copepod). Sự hiện diện của nhóm copepod trong ao cho thấy đây là một hệ sinh thái ổn định và bền vững, vì nhóm động vật giáp xác này thường ăn vi khuẩn và các nhóm vi tảo trong ao. Ngoài ra, việc sử dụng công nghệ nuôi nước xanh (greenwater, hệ thống nuôi tảo chiếm ưu thế) cũng có tỷ lệ bùng phát dịch bệnh EMS/AHPND ở mức độ thấp. Hệ thống nước xanh, được đặc trưng bởi một hệ sinh thái đã “trưởng thành” bởi sự hiện diện của các nhóm vi tảo và quần thể vi khuẩn. Trong môi trường này, mật độ vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio giảm thấp so với đối chứng và tỷ lệ chết của tôm giảm trong những nghiên cứu trước đó. Có nhiều cơ chế để giải thích cho vấn đề này như, do tảo sản xuất ra các hợp chất có khả năng kháng khuẩn và các hợp chất có khả năng ức chế các gen sản sinh ra độc tố trong môi trường nước xanh. Tuy nhiên, tôi cho rằng các vi khuẩn có liên quan đến các vi tảo cũng không nên bỏ qua, như là việc chúng có thể cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh và sản xuất ra các hợp chất có khả năng ảnh hưởng đến sự tồn tại và/hoặc hoạt động của các tác nhân gây bệnh.

Tương tự như công nghệ nước xanh, hệ thống nuôi với quần thể vi sinh vật chiếm ưu thế có thể giảm thiểu sự phát triển của và hiện diện của các tác nhân gây bệnh trong hệ thống nuôi. Sự “trưởng thành” của quần thể vi khuẩn (microbial maturity) trong nước có thể được mô tả dựa trên lý thuyết về sự chọn lựa của hệ sinh thái được đặc trưng bởi hệ số r/K. Một hệ vi khuẩn trưởng thành được đặc trưng bởi sự thống trị của các vi khuẩn phát triển chậm và ổn định, với một nguồn cung cấp chất dinh dưỡng hạn chế cho mỗi loại vi khuẩn, và gọi là hệ số K. Một đại lượng đặc trưng cho khả năng tạo ra các “không gian” trống để các nhóm vi khuẩn khác phát triển nhanh chóng gọi là hệ số r, bao gồm nhiều nhóm vi khuẩn gây bệnh như Vibrio ssp. Như vậy, khi hệ số K càng lớn trong ao nuôi thì khả năng giảm thiểu nhóm vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND trong ao nuôi tôm càng lớn. Việc quản lý ao nuôi để làm tăng hệ số K có liên quan đến việc giảm thiểu sự thay đổi đột ngột của mức độ dinh dưỡng trong nước nuôi, nhằm đảm bảo việc cung cấp dinh dưỡng cho mỗi loại vi khuẩn ở mức thấp, ổn định và liên tục để giữ đặc tính cạnh canh giữa các nhóm vi khuẩn với nhau trong ao. Do đó, trong trường hợp khử trùng ao nuôi, chúng ta phải bổ sung hệ vi sinh vật có lợi trong ao trước khi thả giống tôm nhằm làm giảm hệ số r và từ đó giảm thiểu sự phát triển của nhóm vi khuẩn gây bệnh trong ao nuôi.

Một điều cần phải nhấn mạnh trong cách tiếp cận này là nhằm ngăn chặn mầm bệnh EMS/AHPND chứ không phải chữa bệnh EMS/AHPND khi tôm đã bị nhiễm bệnh. Trong trường hợp chữa bệnh EMS/AHPND, chúng ta nên phát triển và ứng dụng các kỹ thuật có ảnh hưởng thấp nhất đến hệ sinh thái ao nuôi, nhất là quần thể vi sinh vật. Theo thông tin mới cập nhật trong danh sách các loại thuốc thú y được phê duyệt bởi Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), kháng sinh Flofenicol đã được chấp nhận sử dụng trong điều trị một số loại bệnh trên tôm he (penaeid) do nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra như Vibrio harveyi, V. penaeicida và V. parahaemolyticus.

Bởi vì các gen độc lực có trên plasmid, độc lực có thể được truyền không chỉ giữa các chủng V. parahaemolyticus với nhau mà còn đối với các loài vi khuẩn Vibrio khác. Ví dụ như: Ở Việt Nam, một chủng vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND gọi là KC13.17.5, đã được phân lập và xác định là vi khuẩn Vibrio sp., nhưng trình tự gen 16S rRNA cho thấy rằng nó không phải là vi khuẩn V. parahaemolyticus. Do đó, một phương pháp kiểm soát sự hiện diện của tất cả các nhóm vi khuẩn thuộc giống Vibrio trong ao nuôi sẽ có cơ hội giảm được bệnh EMS/AHPND cao nhất. Cuối cùng, chúng ta phải chắc chắn một điều là phải chọn con giống không mang mầm bệnh EMS/AHPND trước khi thả nuôi.

Nguồn: http://aquanetviet.com